在我國，每8對夫婦中就有1對有不孕不育問題，而甲狀腺癌的發(fā)病率也以每年12.4%的速度增長。糖蛋白激素是輔助生殖、治療甲狀腺等疾病的關(guān)鍵藥物。雖然近幾十年來，糖蛋白激素的臨床應(yīng)用已經(jīng)取得很大成功，但它如何激活人體細胞中的受體機制，是長期以來科研人員難以打開的“黑匣子”。
在9月22日發(fā)表于《自然》的一項研究中，中國科學院上海藥物研究所（以下簡稱中科院上海藥物所）研究員徐華強、蔣軼、蔣華良等聯(lián)合浙江大學教授張巖團隊和北京協(xié)和醫(yī)院院長張抒揚團隊打開了這個“黑匣子”，首次解析了糖蛋白激素受體，即全長促黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體（LHCGR）處于失活狀態(tài)和多種激活狀態(tài)下的四個結(jié)構(gòu)，為糖蛋白激素如何識別與激活其受體提供了詳細的分子機制，有助于臨床開發(fā)替代激素治療的小分子藥物。
起底“激活狀態(tài)”下的受體結(jié)構(gòu)
激素作為人體的化學信使，控制著各個器官的生理功能，而下丘腦和腦下垂體是內(nèi)分泌激素的控制中心。傳統(tǒng)內(nèi)分泌系統(tǒng)由下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）、下丘腦-垂體-甲狀腺軸（HPT）和下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）三大分支組成。
糖蛋白激素主要分為兩類，均為重要的臨床治療藥物。一類是促性腺激素，包括促黃體生成素(LH)、促卵泡激素（FSH）和絨毛膜促性腺激素（CG），它們對調(diào)控HPG軸的關(guān)鍵生理功能具有重要意義。其中，F(xiàn)SH和LH可以用于輔助生殖及體外受精，以及治療女性不孕癥和男性促性腺功能減退癥等；CG可以用來誘導女性排卵，增加男性精子數(shù)量等。
而另一類糖蛋白激素是促甲狀腺激素（TSH），它是HPT軸調(diào)節(jié)的關(guān)鍵糖蛋白激素，主要通過調(diào)控機體甲狀腺素的水平來調(diào)節(jié)人體代謝。TSH與131I聯(lián)合可應(yīng)用于甲狀腺癌術(shù)后患者，抑制和消融殘余癌組織等。
雖然糖蛋白激素在臨床應(yīng)用取得了成功，但它如何激活人體細胞中的受體機制始終未解，這極大地限制了人們對該類受體的激素選擇性，以及受體激活機制的理解。此外，結(jié)構(gòu)信息的缺乏也制約了靶向該類受體的小分子治療藥物的研發(fā)。
實際上，糖蛋白激素受體結(jié)構(gòu)的難解，與其結(jié)構(gòu)的特殊性有密切關(guān)系。糖蛋白激素受體為A類G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），但與大多數(shù)A類GPCR不同，它包含由340-420個氨基酸構(gòu)成的巨大N端胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域（ECD），該結(jié)構(gòu)域由富含亮氨酸的重復序列構(gòu)成，且存在復雜的糖基化修飾。
徐華強告訴《中國科學報》，“因為特殊結(jié)構(gòu)，糖蛋白激素受體很難重組表達。此外，糖蛋白激素受體除了傳統(tǒng)的跨膜區(qū)，還有一個較大的胞外區(qū)，這也造成它的表達非常不穩(wěn)定。”
體外獲得全長的激素受體可謂困難重重。該論文的第一作者，中科院上海藥物所博士研究生段佳，在剛?cè)雽W時，就“鉆”了這項研究。由于此前沒有糖蛋白激素及其全長受體復合物結(jié)構(gòu)的相關(guān)報道，他們只能摸著石頭過河。
“擺在我們面前的第一個難題就是CG配體。一般情況下，我們都是自己表達純化配體，但‘折騰’了2個月后，發(fā)現(xiàn)效果并不理想。”段佳告訴《中國科學報》。
在一次上網(wǎng)查資料時，她驚喜地發(fā)現(xiàn)醫(yī)院有現(xiàn)成的CG處方藥，“如果使用處方藥，可能效果會不錯。”果然，后續(xù)的實驗證明了這一猜想。為了獲得更多的CG配體，他們又多方聯(lián)系買到了藥物的原料藥，進而解決了CG配體的難題。
后續(xù)的困難接踵而至。段佳發(fā)現(xiàn)，常規(guī)方法制備出的蛋白量不僅很少，而且結(jié)果也不穩(wěn)定。通過查閱大量文獻，她發(fā)現(xiàn)，糖蛋白激素受體存在很多點突變，而這些突變會引起一系列疾病。為此，她對文獻中涉及的所有突變進行了篩選，最后鎖定了能夠使受體持續(xù)性激活的突變S277I。“通過引入這一突變，不僅讓受體更加穩(wěn)定，還提高了受體的表達量。”
在單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的“加持”下，研究團隊最終解析了3個近原子分辨率的全長LHCGR處于激活狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，包括結(jié)合內(nèi)源性激素CG的LHCGR（野生型）受體結(jié)構(gòu)（4.3埃）、結(jié)合內(nèi)源性激素CG的LHCGR（含持續(xù)性激活突變S277I）受體結(jié)構(gòu)（3.8埃）以及結(jié)合內(nèi)源性激素CG和小分子化合物Org43553的LHCGR（含持續(xù)性激活突變S277I）受體結(jié)構(gòu)（3.2埃）。
不能缺位的“失活狀態(tài)”
解開激活狀態(tài)下的全長LHCGR結(jié)構(gòu)謎團，對于研發(fā)團隊而言只是第一步。“很多現(xiàn)象，僅靠解析激活狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)是不夠的。”段佳說，“以往解析GPCR時，都是配體與受體的跨膜區(qū)相互作用后，引起跨膜區(qū)的構(gòu)象變化，進而激活受體。但對于糖蛋白激素受體的激活，配體僅僅與受體胞外域相互作用，在沒有接觸到受體跨膜區(qū)的情況下，仍然能夠引起跨膜區(qū)構(gòu)象的變化。”
這意味著，只有繼續(xù)解析失活狀態(tài)下的糖蛋白激素受體結(jié)構(gòu)，才能完整地揭示該類受體的激活機制。雖然激活狀態(tài)下的解析工作為后續(xù)研究奠定了重要基礎(chǔ)，但仍然遇到了很多困難。
“在開展這項研究之前，沒有任何單獨GPCR的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)報道。而糖蛋白激素受體非常不穩(wěn)定，可能純化過程中就降解了。”段佳說。
通過查閱文獻，研究團隊又嘗試了很多辦法，例如在蛋白上加上融合標簽等，但效果并不明顯。他們想，也許在純化蛋白的過程中加入小分子抑制劑能使蛋白更加穩(wěn)定。
通過這種方式，研究團隊克服了全長失活受體構(gòu)象高度不穩(wěn)定的技術(shù)難題，并通過擴大數(shù)據(jù)量，最終解析了失活狀態(tài)下全長LHCGR的電鏡結(jié)構(gòu)，分辨率為3.8埃。
通過對比激活LHCGR結(jié)構(gòu)，研究人員發(fā)現(xiàn)受體的ECD發(fā)生了大約45度的偏轉(zhuǎn)。進一步通過結(jié)構(gòu)分析和功能試驗驗證，他們最終提出了LHCGR受體“Push and Pull”的受體激活模型，也就是糖蛋白激素受體激活的“推拉”模型。“這是第一個全長單獨GPCR的電鏡結(jié)構(gòu)。”徐華強說。
助攻小分子藥物研發(fā)
近年來，小分子藥物研發(fā)逐漸表現(xiàn)出巨大優(yōu)勢，也越來越受到患者和市場的青睞。
徐華強表示，“一方面，小分子藥物可以口服，相對于打針等治療方式，可以減少患者身體痛苦和心理負擔；另一方面，小分子藥物可控性和依從性更強，可以做到定時定量。”
為此，研究人員還解析了處于1期臨床試驗中的小分子化合物Org43553與LHCGR相互作用的分子細節(jié)，揭示了Org43553的結(jié)合口袋，為臨床開發(fā)針對LHCGR、FSHR和TSHR的選擇性小分子藥物替代激素治療提供了重要的結(jié)構(gòu)模板。
實際上，國內(nèi)外對糖蛋白激素的關(guān)注由來已久。十年前，徐華強團隊就開始研究糖蛋白激素受體的結(jié)構(gòu)，但受限于當時的結(jié)構(gòu)解析技術(shù)，研究僅開展兩年便被迫擱置。
隨著冷凍電鏡技術(shù)的革命，兩年前，徐華強團隊聯(lián)合合作者再次重啟這該項目。在他看來，除了技術(shù)的進步，研究之所以成功，還得益于中科院上海藥物所的技術(shù)和平臺支撐，不同方向團隊的精誠合作，以及學生們善于發(fā)現(xiàn)問題并解決問題的主觀能動性。
“糖蛋白激素受體結(jié)構(gòu)的解析只是第一步，也是最關(guān)鍵的一步。雖然糖蛋白激素的作用機制在整個家族是通用的，但與受體之間也存在特異性，仍然需要結(jié)構(gòu)生物學來解答。此外，我們還希望進一步解析促卵泡激素和促甲狀腺激素等受體的結(jié)構(gòu)，揭示不孕不育、甲亢或甲減等疾病的分子機制，為治療相關(guān)疾病藥物的研發(fā)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。”徐華強表示。
